การสำรวจเบื้องต้นเกี่ยวกับราในดินบริเวณเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ด้านตะวันออก

Preliminary Survey on Soil Fungi at Eastern Thungyai Naresuan Wildlife Sanctuary

บทคัดย่อ

                 การสำรวจชนิดของราในดินบริเวณเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ด้านตะวันออก จังหวัดตาก ได้ทำการสุ่มเก็บตัวอย่างดินในเดือนพฤษภาคม พ.ศ. 2542 มาทำการแยกเชื้อราโดยวิธี dilution plate บนอาหาร Gochenaur’s glucose ammonium nitrate agar ทำการเพาะเลี้ยงเชื้อราบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม และศึกษารูปร่างลักษณะภายใต้กล้องจุลทรรศน์

                 ผลการศึกษาปรากฏว่า พบราทั้งสิ้น 33 isolates จำแนกได้ 28 ชนิด (species) 14 สกุล (genera) โดยจัดเป็นราในสกุล Penicillium 8 isolates, Aspergillus 6 isolates, Trichoderma 4 isolates, Rhizopus 3 isolates, Mucor 2 isolates, Paecilomyces 2 isolates, Acremonium, Cladosporium, Fusarium, Gongronella, Heterocephalum, Metarrhizium, Myriodontium และ Verticillium ชนิดละ 1 isolate

                 เชื้อราที่พบมีความสามารถในการย่อยสลายน้ำตาล, แป้ง, hemicellulose, pectin, cellulose และ chitin 4, 5, 1, 8, 7 และ 3 ชนิดตามลำดับ มีเชื้อรา 7 ชนิดที่เป็นสาเหตุที่ทำให้เกิดโรคกับมนุษย์

คำหลัก : ราในดิน, เขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร, วิธี dilution plate

Abstract

                 The survey on species of microfungi in soil at Eastern Thunyai Naresuan Wildlife Sanctuary, Tak Province, the samples of soil were collected in May 1999. Dilution plate method and Gochenaur’s glucose ammonium nitrate agar were used. Identification was base on macroscopic and microscopic characteristics as observed on artificial media and under stereo- and compound microscopes.

                   Microfungi isolated included 8 isolates of Penicillium, 6 isolates of Aspergillus, 4 isolates of Trichoderma, 3 isolates of Rhizopus, 2 isolates of Paecilomyces, 1 isolate of Acremonium, Cladosporium, Fusarium, Gongronella, Hetercephalum, Metarrhizium, Myriodontium and Verticillium.

                   Their capacity in sugar, starch, hemicellulose, pectin, cellulose and chitin decomposition were 4, 5, 1, 8, 7 and 3 species, respectively. Human pathogens were found 7 species.

______________________

    Forest Environment Research and Development Division, Forest Research Office,
    Royal Forest Department, Chatuchak, Bangkok 10900

   Wildlife Conservation Division, Natural Resources Conservation Office,
   Royal Forest Department, Chatuchak, Bangkok 10900

Key words : Soil fungi, Thungyai Naresuan Wildlife Sanctuary, Dilution plate method

คำนำ

                 ในระบบนิเวศป่าไม้ เชื้อราจัดเป็นองค์ประกอบที่มีความสำคัญอย่างมากในบทบาทเป็นผู้ย่อยสลายซากพืช ซากสัตว์หรือซากอินทรีย์วัตถุให้กลายเป็นอนินทรียสารที่พืชสามารถนำกลับไปใช้ประโยชน์ได้อีกครั้งหนึ่ง เกิดเป็นห่วงโซ่อาหาร (food chians หรือ food webs) ขึ้นหมุนเวียนในระบบนิเวศป่าไม้ กลไกพื้นฐานในการย่อยสลายคือ การที่เชื้อราปล่อยเอนไซม์ที่เรียกว่า extra cellular enzyme หรือ exoenzyme ออกมาย่อยโมเลกุลของซากพืชที่มีขนาดใหญ่ให้เล็กลงแล้วดูดซึมผ่านผนังเซลล์ โดยปัจจัยที่มีผลต่อการย่อยสลายซากพืชประกอบด้วย 3 ปัจจัยหลัก คือ สิ่งแวดล้อม คุณสมบัติของซาก และกลุ่มผู้ย่อยสลาย ซึ่งปัจจัยเหล่านี้มีความสัมพันธ์ร่วมกัน การที่ในระบบนิเวศมีความหลากชนิดของเชื้อราสูงจะทำให้การย่อยสลายเป็นไปได้เร็วขึ้น เป็นผลให้ดินมีความอุดมสมบูรณ์สูง และเป็นการลดปริมาณเชื้อเพลิงได้เป็นอย่างดีสำหรับพื้นที่ที่เกิดไฟป่าเป็นประจำ ปัจจัยที่มีผลต่อความหลากหลายของชนิดพันธุ์เชื้อรา ได้แก่ แหล่งอาหาร ปริมาณความชื้น อุณหภูมิและแสงสว่าง ฤดูกาล เป็นต้น (สายัณห์, 2540 และ สุจิตรา, 2541) ดังนั้นการสำรวจเบื้องต้นของราในดินป่าชนิดต่างๆ บริเวณเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวรด้านตะวันออก โดยการแยกเชื้อ เพาะเลี้ยง และจำแนกชนิดโดยการศึกษารูปร่างลักษณะและคุณสมบัติของราแต่ละชนิด จึงเป็นข้อมูลพื้นฐานทางการศึกษาที่สำคัญในการศึกษาความหลากชนิดของเชื้อรา (species diversity) เพื่อนำความรู้พื้นฐานด้านบทบาทและกิจกรรมของเชื้อราในระบบนิเวศป่าไม้มาใช้ประโยชน์ในการจัดการป่าไม้ อีกทั้งยังเป็นการเก็บรักษาแหล่งพันธุกรรมของเชื้อราเพื่อการนำไปใช้ประโยชน์ด้านอื่นต่อไปในอนาคต

อุปกรณ์และวิธีการ

1. การเก็บตัวอย่างดิน

                  เก็บตัวอย่างโดยใช้พลั่วขุดดินบริเวณผิวหน้าดิน ลึกประมาณ 10 ซม. นำดินใส่ถุงพลาสติก บันทึกข้อมูลของแหล่งที่เก็บดิน เมื่อมาถึงห้องปฏิบัติการรีบทำการแยกเชื้อโดยเร็วที่สุด

2. การแยกเชื้อรา

                  การแยกเชื้อราจากดินใช้วิธี dilution plate ดังนี้

1. ชั่งดินตัวอย่าง 10 กรัม ละลายในน้ำกลั่นที่ฆ่าเชื้อแล้ว 90 มล. จะได้สารละลายดินที่มีความเข้มข้น 10^-1
2. นำสารละลายที่ได้ไปเจือจางในน้ำให้ได้ความเข้มข้น 10^-2,10^-3 และ 10^-4 ตามลำดับ
3. ใช้ปิเปตดูดสารละลายตัวอย่างใส่จานเลี้ยงเชื้อ ในแต่ละตัวอย่างและแต่ละความเข้มข้น ให้ดูดใส่จานละ 1 มล. ทำ 3 ซ้ำ
4. เทอาหาร Gochenaur’s glucose ammonium nitrate agar (GAN, Gochenaur, 1964) ที่มีส่วนผสมของ Rose Bengal และ Streptomycin ลงในจานเลี้ยงเชื้อหมุนเบาๆ ให้สารละลายตัวอย่างกระจายทั่วจานเลี้ยงเชื้อ
5. นำจานเลี้ยงเชื้อไปเก็บในกล่องอลูมิเนียมเพื่อไม่ให้ถูกแสงสว่าง บ่มในตู้บ่มเชื้อ ที่อุณหภูมิ 26 ° C เป็นเวลา 3 - 5 วัน
6. เมื่อเชื้อราเจริญขึ้นมา ใช้เข็มเขี่ยย้ายโคโลนีเชื้อราแต่ละโคโลนีลงใน slant PDA (Potato Dextrose Agar) แต่ละ isolate นับเป็น 1 isolate
7. เก็บเชื้อบริสุทธิ์ไว้ศึกษาและจำแนกชนิด และนับจำนวน isolate ที่แยกได้ของแต่ละชนิด ในแต่ละตัวอย่างดิน

3. การจำแนกชนิดเชื้อรา

วิธีการจำแนกชนิดเชื้อราที่แยกได้ทำโดยปลูกเชื้อ (inoculate) ราที่จะจำแนกบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมเป็น 3 จุด ให้แต่ละจุดมีระยะห่างจากขอบจานเลี้ยงเชื้อและจากจุดศูนย์กลางเท่าๆ กัน รวมถึงระยะห่างระหว่างจุดเท่ากันด้วย เพื่อที่ว่าสามารถเปรียบเทียบลักษณะของโคโลนีได้ ซึ่งราส่วนมากจะใช้อาหาร PDA ส่วนรา Aspergillus เลี้ยงบนอาหาร CzA (Czapek’s Solution Agar) และ MEA (Malt Extract Agar) และรา Penicillium เลี้ยงบนอาหาร CzA, MEA และ CYA (Czapek’s Yeast Agar) หลังจากปลูกเชื้อแล้วนำไปบ่มไว้ที่อุณหภูมิ 26° C จนเชื้อรามีการเจริญเติบโตที่สามารถสังเกตลักษณะโคโลนีที่เด่นชัดและสร้าง spore ซึ่งจะใช้เวลาแตกต่างกันไปในแต่ละเชื้อ จากนั้นนำมาบันทึกลักษณะการเจริญ วัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง ถ่ายภาพโคโลนี แล้วนำไปศึกษาลักษณะรูปร่างต่างๆ ของราอย่างละเอียด ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบ Stereo และแบบ Compound พร้อมทั้งถ่ายภาพลักษณะต่างๆ ที่สำคัญของราภายใต้กล้องทั้งสอง นำรายละเอียดทั้งหมดที่ได้จากการศึกษาไปเปรียบเทียบกับเอกสารทางด้านอนุกรมวิธานเพื่อจำแนกชนิดรา (Barnett และ Hunter, 1972; Domsch และคณะ,1980, Ellis, 1971; Hoog และ Guarro, 1995; Raper และ Thom, 1949; Raper และ Fennell, 1965; Ramirez, 1982 และ Rifai, 1969)

4. สถานที่ทำการศึกษา

การศึกษาครั้งนี้ได้เก็บตัวอย่างดินบริเวณเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ด้านตะวันออก จังหวัดตาก ในเดือนพฤษภาคม พ.ศ. 2542 และทำการศึกษารายละเอียดต่าง ๆ และจำแนกชนิดของเชื้อราที่ห้องปฏิบัติการกลุ่มโรคและจุลชีววิทยาป่าไม้ ส่วนวิจัยและพัฒนาสิ่งแวดล้อมป่าไม้ สำนักวิชาการป่าไม้ กรมป่าไม้ กรุงเทพฯ

ผลและวิจารณ์

การศึกษาเพื่อสำรวจชนิดของเชื้อราในดินในเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ด้านตะวันออก ครั้งนี้สามารถจำแนกได้ทั้งหมด 28 ชนิด ดังมีรายชื่อดังต่อไปนี้

1. Acremonium sp. Link
2. Aspergillus clavatus Desmazieres
3. Aspergillus janus Raper & Thom
4. Aspergillus niger van Tieghem
5. Aspergillus sydowii (Bain. & Sart.) Thom & Church
6. Aspergillus ustus (Bainier) Thom & Church
7. Cladosporium oxysporum Berkley & Curtis
8. Fusarium oxysporum Schlecht
9. Gongronella butleri Lender Peyronel & Dal Vesco
10. Heterocephalum sp. Thaxter
11. Metarrhizium anisophiae (metschn.) Sorok. var. anisopliae
12. Mucor sp. Micheli ex Fr.
13. Myriodontium sp.
14. Paecilomyces marquandii (Massee)
15. Paecilomyces sp.1
16. Penicillium sp.1
17. Penicillium sp.2
18. Penicillium sp.3
19. Penicillium sp.4
20. Penicillium sp.5
21. Penicillium sp. 6
22. Penicillium sp. 7
23. Penicillium sp. 8
24. Rhizopus sp. Ehrenberg
25. Trichoderma hamatum (Bnorden) Bainie
26. Trichoderma harzianum Rifai aggr.
27. Trichoderma piluliferum Webster & Rifai aggr.
28. Verticillium chlamydosporium Goddard

              ซึ่งจากผลการศึกษาครั้งนี้ได้ทำการศึกษาต่อถึงบทบาทของเชื้อราทุกชนิดที่แต่ละชนิดมีหน้าที่สำคัญต่อระบบนิเวศป่าไม้แตกต่างกันไป สามารถสรุปบทบาทของเชื้อราชนิดต่าง ๆ ได้ดังแสดงในตาราง

ตารางแสดงบทบาทและความสำคัญของราที่พบ

 ก. ลักษณะ Vesicle, conidiophores และ conidia ของราในสกุล Aspergillus spp.

ข. ลักษณะ conidiophores, metulae, phialides และ conidia ของราในสกุล Penicillium spp.

ค. ลักษณะ conidiophores, phialides และ conidia ของราในสกุล Trichoderma spp.

ภาพแสดงลักษณะรูปร่างภายใต้กล้องจุลทรรศน์ของราในสกุล Aspergillus, Penicillium และ Trichoderma

                  ราในดินที่พบมากในการศึกษาครั้งนี้จัดอยู่ในกลุ่ม Hyphomycetes โดยราที่พบมากได้แก่ Aspergillus, Penicillium และ Trichoderma ดังแสดงตามภาพ ทั้งนี้เนื่องจากวิธี soil dilution plate เป็นวิธีที่ใช้แยกเชื้อราที่ส่วนใหญ่มาจากสปอร์และราทั้ง 3 สกุลจัดว่าเป็นราที่สามารถแยกได้ในดินส่วนใหญ่ (Carlile และ Watkinson, 1996) หากต้องการแยกเพื่อศึกษาความหลากชนิดของราในดินป่าจะต้องใช้วิธีการที่แตกต่างออกไป เช่น soil plate method, alcohol treatment method, heat treatment method และ baiting method (อ้างโดยเลขาและคณะ, 2542)

สรุปและข้อเสนอแนะ

                  จากการเก็บตัวอย่างดินที่เขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ด้านตะวันออก จังหวัดตาก มาทำการแยกเชื้อราด้วยวิธี dilution plate โดยใช้อาหาร Gochenaur's glucose ammonium nitrate agar บ่มไว้ในที่มืด แยกเชื้อราได้ทั้งสิ้น 33 isolates จำแนกได้ 28 ชนิด (species) ดังนี้คือ Penicillium 8 isolates, Aspergillus 6 isolates, Trichoderma 4 isolates, Rhizopus 3 isolates, Mucor 2 isolates, Paecilomyces 2 isolates และ Acremonium, Cladosporium Fusarium, Gongronella, Heterocephalum, Metarrhizium, Myriodontium และ Verticillium ชนิดละ 1 isolate ซึ่งเชื้อราทุกชนิดนั้นมีรายงานว่าสามารถแยกได้จากดินในป่า และแต่ละชนิดมีบทบาทที่สำคัญต่อระบบนิเวศป่าไม้แตกต่างกันไป สามารถสรุปบทบาทของเชื้อราต่างๆ ได้ดังแสดงไว้แล้วในตาราง

                  สำหรับการศึกษาถึงชนิดของราในดินในครั้งต่อไปควรที่จะต้องใช้วิธีในการแยกเชื้อจากดินหลายวิธีร่วมกัน เพื่อให้ได้จำนวนชนิดของเชื้อราที่มีความหลากหลายมากยิ่งขึ้น

                  นอกจากนี้แล้วเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ด้านตะวันออกนั้นมีสภาพป่าที่อุดมสมบูรณ์และปกคลุมไปด้วยสังคมพืชที่หลากหลายสังคมด้วยกัน อาทิเช่น ป่าดงดิบเขา ป่าดงดิบแล้ง ป่าเบญจพรรณ ป่าเต็งรังและสังคมทุ่งหญ้าที่กำลังทดแทน ดังนั้นควรที่จะมีการศึกษาต่อไปถึงชนิดของราที่พบในดิน แยกตามสังคมพืช เพื่อทราบถึงชนิดของราชนิดใดบ้างที่มีความเฉพาะเจาะจงกับสังคมพืช ทั้งนี้เพื่อหากในอนาคตมีเหตุที่จำเป็นต้องสูญเสียสังคมพืชไป ก็จะทำให้ทราบว่าเราได้สูญเสียความหลากหลายของราในดินที่มีความเฉพาะเจาะจงกับสังคมพืชชนิดใดลงไปบ้าง เพื่อที่จะได้จัดการวางแผนการอนุรักษ์ความหลากหลายทางชีวภาพในส่วนนี้ต่อไป

เอกสารอ้างอิง

เลขา มาโนช, จินตนา ชะนะ และ วิรัช ชูบำรุง. 2542. สายพันธุ์เชื้อราที่มีความสำคัญในประเทศไทย.
                      ใน การประชุม ทางวิชาการครั้งที่ 37 สาขาพืช มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. กรุงเทพฯ. หน้า 281-289.

สายัณห์ สมฤทธิ์ผล. 2540. การย่อยสลายของซากใบไผ่และใบรังในป่าผสมผลัดใบและราที่ย่อยสลาย.
                      วิทยานิพนธ์ ปริญญาโท มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ กรุงเทพฯ

สุจิตรา โกศล. 2541. ชนิดและปริมาณของราในดิน น้ำ และพืชภายใต้แปลงปลูกสัก ลุ่มน้ำลิ่นถิ่น
                      จังหวัดกาญจนบุรี. วิทยานิพนธ์ปริญญาโท. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ กรุงเทพฯ

Barnett L. H. and Hunter, B.B. 1972. Illustrated Genera of Imperfect Fungi.
                      Burgess Publishing Company, Minnesota. 241 p.

Chalile, M.J. and S.C. Watkinson. 1996. The fungi. Academic Press Limited,
                      London. pp. 277-305.

Domsch, K. H., W. Gams and T. Anderson. 1980. Compendium of Soil Fungi :
                      Volume I. Academic Press, London. 405 p.

Ellis , B.M. 1971. Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological
                      Institute, Kew, Surrey, England. 608 p.

Gilman, C. J. 1975. A Manual of Soil Fungi. Oxford & IBH Publishing Co.
                      New Delhi. 450 p.

Hoog de G.S. and J. Guarro. 1995. Atlas of Clinical fungi. Centraalburequ
                      voor Schimmelcultures, Baarn and Delft, The Netherlands. 720 p.

Raper , K.B. and C. Thom. 1949. A Manual of the Penicilli. Hafnes Publishing
                      Company, New York. 875 p.

Raper, K.B. and D.I. Fennell. 1965. The genus Aspergillus. Williams and
                      Wilkins Co., Baltimore, Maryland. 686 p.

Ramirez, C. 1982. Manual and Atlas of the Penicillia. Elsevier Bilmedical Press,
                      Amsterdam, The Netherland. 874 p.

Rifai, A.M. 1969. A Revision of the Genus Trichoderma. Mycological Papers
                      No.116 56 p.

Waterhouse, D.F. 1998. Biological Control of Insect Pests : Southeast Asian
                      Prospects. ACIAR Monograph No. 51. 548p.